События 8 июня. День социального работника в России. День таинственных знаков и предсказаний

в микробиологии: устройство микроскопа и основные приемы микроскопирования живых микроорганизмов

1 Особенности разных видов микроскопии

2 Устройство светлопольного микроскопа

3 Правила работы с иммерсионным объективом

4 Приемы микроскопирования живых микроорганизмов

1 Особенности разных видов микроскопии

Основными задачами микроскопии являются следующие:

Выявление микроорганизмов в различных материалах.

Ориентировочная идентификация микроорганизмов в образце.

Изучение некоторых морфологических признаков и структур микроорганизмов (например, капсул, жгутиков и т. д.).

Изучение окрашенных мазков из колоний и чистых культур.

На сегодняшний день наиболее используемой является световая микроскопия.

Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2–3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма. Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того, что объект и различные его структуры избирательно поглощают свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст).

Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность – это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0,2 мм. Контраст изображения – это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3–4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, изменяющие световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча. Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света – цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов – 10, 40 и 100. Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1 000. Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2 000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается. Напротив, качество изображения ухудшается.

Числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы. Числовая апертура – это оптический «охват» линзы, она является мерой количества света, попадающего в линзу. Числовая апертура объектива указана на его оправе. Апертура конденсора должна соответствовать числовой апертуре объектива. Числовая апертура любой линзы, граничащей с воздухом (т.е. «сухой системы»), не может превысить 1, так как показатель преломления воздуха равен 1. Числовую апертуру можно повысить, если увеличить показатель преломления среды между фронтальной линзой объектива и предметным стеклом, приблизив его к показателю преломления стекла (1,5). Для этого между фронтальной линзой объектива и исследуемым объектом помещают каплю жидкости с показателем преломления большим, чем показатель преломления воздуха, например, каплю воды (n = 1,3), глицерина (n = 1,4) или кедрового (иммерсионного) масла (n = 1,5). Для каждой из указанных выше жидкостей выпускаются специальные объективы, которые называются иммерсионными.

Световая микроскопия включает обычную просвечивающую микроскопию (светло-, темнопольную), фазово-контрастную, люминесцентную. В последнее время разработаны и другие способы микроскопии и микроскопы – инверсионная и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.

Светлопольная микроскопия позволяет исследовать объекты в проходящем свете в светлом поле. Данный вид микроскопии предназначен для исследования морфологии, размеров клеток, их взаимного расположения, структурной организации клеток и других особенностей. У светового микроскопа максимальная разрешающая способность составляет 0,2 мкм, что обеспечивает высокоточное увеличение микроскопа до 1500х.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет более четко наблюдать живые прозрачные объекты, которые имеют коэффициенты преломления, близкие к коэффициентам преломления среды. Действие фазово-контрастного микроскопа основано на интерференции света в плоскости изображения, обусловленной сдвигом по фазе (при использовании фазового кольца в апертурной диафрагме). При фазово-контрастной микроскопии часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики – инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор – сверху.

С помощью фазово-контрастной микроскопии изучают форму, размеры, взаимное расположение клеток, их подвижность, размножение, прорастание спор микроорганизмов и т. д. Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Темнопольная микроскопия основана на освещении объекта косыми лучами света. При таком освещении лучи не попадают в объектив, поэтому поле зрения выглядит темным. Такое освещение препарата достигается использованием специального темнопольного конденсора. Темнопольная микроскопия является очень простым, но эффективным методом и хорошо подходит для получения изображения живых и неокрашенных биологических образцов. Учитывая простоту установки, качество получаемых изображений весьма хорошее.

При микроскопировании в темном поле можно увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, что находится за пределами разрешающей способности обычного светлопольного микроскопа. Однако наблюдение за объектами в темном поле позволяет исследовать только контуры клеток и не дает возможности рассмотреть их внутреннюю структуру.

Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия основана на способности ряда веществ биологического происхождения или некоторых красителей светиться при их освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом. При использовании ультрафиолетового света разрешающая способность микроскопа может достигать 0,1 мкм.

Клетки микроорганизмов обрабатывают специальными красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, примулин, родамин и др.) в виде сильно разбавленных водных растворов: 1:500–1:100 000. Такие растворы слабо токсичны, что дает возможность изучать неповрежденную клетку. В зависимости от химического состава, клеточные структуры в разной степени адсорбируют красители и люминесцируют различным образом. Кроме того, флуорохромы неодинаково адсорбируются живыми и мертвыми клетками. Это позволяет использовать данный вид микроскопии для цитологических и иммунологических исследований, определения жизнеспособности клеток и т. д.

Электронная микроскопия позволяет обнаружить объекты, которые не разрешаются при использовании световых или ультрафиолетовых лучей. Теоретически разрешение просвечивающего электронного микроскопа составляет 0,002 нм; реальное разрешение современных электронных микроскопов приближается к 0,1 нм. На практике разрешение для биологических объектов достигает 2 нм.

Короткая длина волны электронов позволяет различить объекты размером 0,5–1,0 нм. В современных электронных микроскопах на экране достигается увеличение 5000– 200 000. Благодаря столь высокому разрешению становится возможным выявление деталей бактериальных структур. Например, с помощью напыления солей тяжелых металлов, окружающих бактерию и проникающих в поверхностные неровности, получают контрастирование за счет дифференциальной задержки электронов. Этот эффект получил название негативного контрастирования .

Электронный микроскоп, в котором изображение формируется благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называют просвечивающим (или трансмиссионным ).

В сканирующем электронном микроскопе (растровая электронная микроскопия (РЭМ) пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое формирует изображение на светящемся экране. Для РЭМ характерны высокая разрешающая способность, большой диапазон увеличений (до 100 000 и выше), большая глубина фокусировки (~100 мкм), многообразие режимов работы. Сканирующий микроскоп дает картину поверхностей и позволяет получать трехмерное изображение.

Лазерная конфокальная микроскопия дает возможность получить отчетливое изображение и наблюдать объекты в фокусе по всему полю. Данный метод пригоден лишь для исследования самосветящихся (флуоресцентных) объектов. При сочетании с компъютерной техникой возможна пространственная реконструкция изучаемого объекта. В конфокальном лазерном сканирующем микроскопе изображения внутренних сечений формируются за счет сканирования сфокусированным лазерным пучком от разных (405, 488, 532, 635 нм) лазеров и пространственной фильтрации излучения. При использовании сканирующей микроскопии ближнего поля (СМБП) достигается высокая разрешающая способность. Наименьший размер элемента, полученного с помощью СМБП, составляет 20 нм при длине волны света 0,486 нм. В изображении контролируемого элемента отсутствуют дифракционные или интерференционные эффекты, затрудняющие определение его границ. Отличительной особенностью СМБП по сравнению с атомно-силовым микроскопом является чувствительность к оптическим характеристикам поверхности контролируемого образца, длине волны света, люминесценции и др.

Компьютерная интерференционная микроскопия позволяет получить высококонтрастное изображение при наблюдении субклеточных структур; во многих случаях применяется для изучения живых клеток. Принцип действия автоматизированного интерференционного микроскопа основан на интерференции световых пучков лазерного излучения, отраженного от опорного зеркала и зеркала, на котором помещен измеряемый фазовый объект. Теоретически предельно достижимая разрешающая способность может составить в среднем 0,2 нм, практически она составляет 0,4 мкм.

Рентгеновская компьютерная томография (РКТ), позитронная эмиссионная томография (ПЭТ) позволяют наблюдать объекты в обычных условиях.

Микроскопические методы исследования

способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей глаза человека. Основу М.м.и. составляет световая и электронная . В практической и научной деятельности врачи различных специальностей - вирусологи, микробиологи, цитологи, морфологи, гематологи и др. помимо обычной световой микроскопии используют фазово-контрастную, интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическую, ультрафиолетовую, инфракрасную микроскопию. В основе этих методов лежат различные свойства света. При электронной микроскопии изображение объектов исследования возникает за счет направленного потока электронов.

Для световой микроскопии и основанных на ней других М.м.и. определяющее значение помимо разрешающей способности Микроскоп а имеет и направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, который может быть прозрачным и непрозрачным. В зависимости свойств объекта изменяются физические свойства света - его и яркость, связанные с длиной и амплитудой волны, плоскость и направление распространения волны. На использовании этих свойств света и строятся различные М.м.и. Для световой микроскопии биологические объекты обычно окрашивают с целью выявления тех или иных их свойств (рис. 1 ). При этом ткани должны быть фиксированы, т.к. выявляет определенные структуры только убитых клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает ее структуры. Однако в световом микроскопе можно изучать и живые биологические объекты с помощью метода витальной микроскопии. В этом случае применяют темнопольный , который встраивают в .

Для исследования живых и неокрашенных биологических объектов используют также фазово-контрастную микроскопию. Она основана на дифракции луча света в зависимости от особенностей объекта излучения. При этом изменяется длина и фаза световой волны. специального фазово-контрастного микроскопа содержит полупрозрачную фазовую пластинку. Живые микроскопические объекты или фиксированные, но не окрашенные и клетки из-за их прозрачности практически не изменяют амплитуду и цвет проходящего через них светового луча. вызывая лишь сдвиг фазы его волны. Однако, пройдя через изучаемый объект, лучи света отклоняются от полупрозрачной фазовой пластинки. В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона возникает разность длины волны. Если эта разность составляет не менее 1 / 4 длины волны, то появляется зрительный эффект, при котором темный объект отчетливо виден на светлом фоне или наоборот в зависимости от особенностей фазовой пластинки.

Интерференционная микроскопия решает те же задачи, что и фазово-контрастная. Но если последняя позволяет наблюдать лишь контуры объектов исследования, то с помощью интерференционной микроскопии можно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный . Это достигается благодаря раздвоению луча света в микроскопе: один из лучей проходит через частицу наблюдаемого объекта, а другой мимо нее. В окуляре микроскопа оба луча соединяются и интерферируют между собой. Возникающую разность фаз можно измерить, определив т. о. массу различных клеточных структур. Последовательное измерение разности фаз света с известными показателями преломления дает возможность определять толщину живых объектов и нефиксированных тканей, концентрацию в них воды и сухого вещества, содержание белков и т.д. На основании данных интерференционной микроскопии можно косвенно судить о проницаемости мембран, активности ферментов, клеточном метаболизме объектов исследования.

Поляризационная микроскопия позволяет изучать объекты исследования в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимноперпендикулярных плоскостях, т.е. в поляризованном свете. Для этого используют пленчатые поляроиды или призмы Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. меняется при прохождении (или отражении) лучей света через различные структурные компоненты клеток и тканей, свойства которых неоднородны. В так называемых изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях - отрицательное двойное лучепреломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными и обладают положительным двойным преломлением света. Такими свойствами обладают миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, нейрофибриллы, коллагеновые волокна и др. Сопоставление характера преломления лучей поляризованного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной организации его структуры (рис. 2 ). Поляризационная микроскопия является одним из гистологических методов исследования (Гистологические методы исследования), способом микробиологической диагностики (Микробиологическая диагностика), находит применение в цитологических исследованиях (Цитологическое исследование) и др. При этом в поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные, так называемые нативные препараты срезов тканей.

Широкое распространение имеет люминесцентная микроскопия. Она основана на свойстве некоторых веществ давать свечение - люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фиолетовой части спектра. Многие биологические вещества, такие как простые , коферменты, некоторые и лекарственные средства, обладают собственной (первичной) люминесценцией. Другие вещества начинают светиться только при добавлении к ним специальных красителей - флюорохромов (вторичная ). Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивают отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта. На этом основано использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях (см. Гистохимические методы исследования). С помощью иммунофлюоресценции в люминесцентном микроскопе выявляют вирусные и их концентрацию в клетках, идентифицируют , определяют антигены и , гормоны, различные продукты метаболизма и т.д. (рис. 3 ). В связи с этим люминесцентную микроскопию применяют в лабораторной диагностике таких инфекций, как , эпидемический , вирусный , грипп и др., используют в экспресс-диагностике респираторных вирусных инфекций, исследуя отпечатки со слизистой оболочки носа больных, и при дифференциальной диагностике различных инфекций. В патоморфологии с помощью люминесцентной микроскопии распознают злокачественные в гистологических и цитологических препаратах, определяют участки ишемии сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют в биоптатах тканей и т.д.

Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ, входящих в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных, прозрачных в видимом свете тканей, поглощать УФ-излучение с определенной длиной волн (400-250 нм ). Этим свойством обладают , такие как , белки, ароматические кислоты ( , триптофан, метилалании), пуриновые и пирамидиновые основания и др. С помощью ультрафиолетовой микроскопии уточняют локализацию и количество указанных веществ, а в случае исследования живых объектов - их изменения в процессе жизнедеятельности.

Инфракрасная микроскопия позволяет исследовать непрозрачные для видимого света и УФ-излучения объекты путем поглощения их структурами света с длиной волны 750-1200 нм . Для инфракрасной микроскопии не требуется предварительной химической обработки препаратов. Этот М.м.и. наиболее часто используют в зоологии, антропологии, других отраслях биологии. В медицине инфракрасную микроскопию применяют в основном в нейроморфологии и офтальмологии.

Для исследования объемных объектов используют стереоскопическую микроскопию. Конструкция стереоскопических микроскопов позволяет видеть объект исследования правым и левым глазом под разными углами. Исследуют непрозрачные объекты при относительно небольшом увеличении (до 120 раз). Стереоскопическая микроскопия находит применение в микрохирургии (Микрохирургия), в патоморфологии при специальном изучении биопсийного, операционного и секционного материала, в судебно-медицинских лабораторных исследованиях.

Для изучения на субклеточном и макромолекулярном уровнях структуры клеток, тканей микроорганизмов и вирусов используют электронную микроскопию. Этот М.м.и. позволил перейти на качественно новый уровень изучения материи. Он нашел широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, генетике, иммунологии, Резкое повышение разрешающей способности электронного микроскопа обеспечивается потоком электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами. Электроны могут проходить через структуры исследуемого объекта (трансмиссионная электронная микроскопия) или отражаться отних (сканирующая электронная микроскопия), отклоняясь под разными углами, в результате чего возникает изображение на люминесцентном экране микроскопа. При трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии получают плоскостное изображение структур (рис. 4 ), при сканирующей - объемное (рис. 5 ). Сочетание электронной микроскопии с другими методами, например с радиоавтографией, гистохимическими, иммунологическими методами исследования (Иммунологические методы исследования), позволяет проводить электронно-радиоавтографические, электронно-гистохимические, электронно-иммунологические исследования.

Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов исследования, в частности химической или физической фиксации тканей и микроорганизмов. Биопсийный материал и секционный материал после фиксации обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на специальных ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы тканей толщиной 30-50 нм . Их контрастируют и затем изучают в электронном микроскопе. В сканирующем (растровом) электронном микроскопе изучают поверхность различных объектов, напыляя на них в вакуумной камере электронно-плотные вещества, и исследуют так называемые реплики, повторяющие контуры образца. См. также Микроскоп .

Рис. 5. Электронограмма лейкоцита и фагоцитируемой им бактерии, полученная при сканирующей электронной микроскопии; ×20000.

1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .

• Микроскопи́ческая те́хника

Смотреть что такое "Микроскопические методы исследования" в других словарях:

Микроскопические методы исследования - исследование объектов экспертизы с помощью микроскопа. В экспертной практике применяются исследования в проходящем свете, в падающем свете (по методам светлого и темного полей), в поляризованном свете, по методу фазового контраста,… … Криминалистическая энциклопедия

МЕТОДЫ ВРАЧЕБНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ - І. Общие принципы врачебного исследования. Рост и углубление наших знаний, все большее, и большее техническое оснащение клиники, основанное на использовании новейших достижений физики, химии и техники, связанное с этим усложнение методов… … Большая медицинская энциклопедия

Археологи по существу подобны детективам, занятым воссозданием и постижением жизни людей прошлых эпох; поэтому неудивительно, что для извлечения информации из материальных следов, оставленных древними людьми, они используют самые разнообразные… … Энциклопедия Кольера

I Обследование больного Обследование больного комплекс исследований, направленных на выявление индивидуальных особенностей больного, установление диагноза болезни, обоснование рационального лечения, определение прогноза. Объем исследований при О … Медицинская энциклопедия

I Кость (os) орган опорно двигательного аппарата, построенный преимущественно из костной ткани. Совокупность К., связанных (прерывно или непрерывно) соединительной тканью, хрящом или костной тканью, образует Скелет. Общее количество К. скелета… … Медицинская энциклопедия

Основана на идентификации возбудителя или выявлении иммунного ответа организма больного на него. Начальным этапом М.д. является отбор материала и транспортировка проб в лабораторию. Вид материала для исследования определяется особенностями… … Медицинская энциклопедия

Хотя бы один раз в год все люди проходят медицинские осмотры. Но мало кто знает, что происходит с их анализами в лаборатории, и какие диагностические мероприятия с ними проводят. А ведь от правильного лабораторного обследования зависит не только здоровье, но иногда даже жизнь. Поэтому методы микроскопического исследования играют немаловажную роль в выявлении и своевременном предупреждении различных вирусных и инфекционных заболеваний.

Микроскопия и ее разновидности

Микроскопия – исследование объектов посредством микроскопа. Предназначена для изучения микроорганизмов, а также иных объектов, которые непостижимы человеческому глазу. Имеет следующую классификацию:

• Стереоскопическая.

Используется для исследования объектов под разными углами, при этом изучая их двумя глазами. Увеличение небольшое – 120-ти кратное. Такой вид микроскопии используют в оперативном лечении маленьких структур организма, которые недосягаемы для человеческого глаза; в изучении мёртвых тканей; в судебной медицине.

• Инфракрасная.

Принцип действия – поглощение непрозрачных объектов, структурами света, длина волн которых достигает 700-1200 нанометров. Чтобы провести инфракрасную микроскопию не нужно производить специальную химическую обработку объекта. Данный метод применяется в зоологии, науках о биологической природе человека. Используется микроскопия в медицине : инфракрасную микроскопию используют в нейрохирургических целях, а также при изучении глаз, их анатомии и физиологии.

• Ультрафиолетовая.

Изучает свойства объекта посредством определения длины волн, которые поглощают ультрафиолетовое излучение, являясь способностью отдельного вещества, клетки, ткани данного объекта. Такой способностью обладают биополимеры, которые хранят генетический код; нуклеиновые кислоты; пропионовые кислоты; альфа-аминокислоты; калиевая соль; продукты азотистого обмена; лекарственные вещества; кристаллические вещества с температурой плавления больше 290 градусов. Благодаря ультрафиолетовой микроскопии определяют место концентрации искомых веществ, а, если объект живой, то можно исследовать его структурные изменения в процессе жизнедеятельности.

• Люминесцентная.

Основной принцип работы – изучение объектов посредством их свойств свечения в ультрафиолетовых лучах или сине-фиолетовой части спектра. Большинство биологических веществ, например, белки, молекулы небелковой природы, низкомолекулярные органические соединения и лекарственные препараты имеют «врожденную» люминесценцию. Иные вещества светятся лишь после добавления конкретных красителей – синтетических соединений природного характера, которые начинают светиться при контакте с ультрафиолетовыми и синими лучами. Такой краситель может попадать в клетку при малейшем контакте, а может распределяться по клеткам избирательно, окрашивая при этом отдельные биосоединения изучаемого объекта. В мероприятиях, посвященных гистохимическим исследованиям, метод люминесцентной микроскопии – это единственный способ обнаружить вирусную концентрацию в клетках, изучить структуру распада продуктов обмена веществ, определить антигены и антитела. Лечение таких болезней, как герпес, гнойное поражение железистых органов, воспаление тканей печени, грипп – не обходится без люминесцентной микроскопии. Также, с ее помощью можно распознать злокачественную опухоль, предупредить сердечно-сосудистые заболевания, исследовать микрофлору слизистой оболочки носа и диагностировать вирусные недуги.

• Интерференционная.

Имеет общую структуру анализа с фазово-контрастной микроскопией, но в отличие от последней, где можно изучать лишь контуры исследуемого объекта, здесь появилась возможность делать микроскопическую экспертизу прозрачных объектов, а также брать количественный анализ. Такой результат появляется вследствие преломления луча света на два пучка: первый проходит через структурные компоненты изучаемого объекта, а второй минует их. В объективе микроскопа кажется, что оба пучка соединяются и налагаются друг на друга. Разница фаз, которая возникает, можно измерить посредством определения массы разнообразных клеточных структур. Если измерять данную разницу последовательно, используя показатели преломления, то можно узнать плотность, ширину и толщину изучаемых объектов и их тканей, содержится ли в них вода или иные компоненты, имеется ли в них белок. Химические и физические свойства мембран, активность ферментов, обмен веществ на клеточном уровне – это лишь малая часть того, что можно узнать благодаря интерференционной микроскопии.

• Фазово-контрастная.
• Рентгеновская.

Применяется для исследования особо малых объектов, которые по своим размерам не больше рентгеновской волны (0,01-1 нм). Подразделяется на следующие подвиды: проекционная, работающая посредством источника излучения и регистрирующего устройства; отражательная – использует специальные монокристаллы, система зеркал, рассеянное на кристалле рентгеновское излучение.

Своё применение рентгеновская микроскопия нашла в изучении генезиса минералов, медицине, а также науке, изучающей химический состав и структуру металлов. Отличительной особенностью данного метода является возможность изучать непрепарированные живые клетки.

Этот рентгеноструктурный анализ может быть лазерным – когда изучаются одиночные молекулы и их связи.

• Поляризационная.

Лучи, которые появляются посредством поляризации двух взаимоперпендикулярных полостей, образуют свет, в котором исследуют различные объекты – это и есть принцип действия поляризационной микроскопии. Между источником излучения и объектом помещают специальные призмы с эффектом двойного лучепреломления, которые отражают электромагнитные и звуковые волны. В сочетании со специальным светофильтром, такая конструкция позволяет изучать анизотропные структуры клеток, микроскопические компоненты тканей, молекулярную организацию структуры объекта. Поляризационная микроскопия используется для исследования клеток и тканей растительных и животных организмов. Также применяется при идентификации возбудителя различных иммунных заболеваний; при изучении жизни клеток, их жизненно важных компонентов, их функций и процесса размножения. Основное назначение данного метода исследования – изучение животных и растительных тканей, минералов, анизотропных микрообъектов.

• Электронная.

Применяется в случае, если объект находится вне пределов видимости оптического микроскопа. Обычно, размер исследуемых образцов, которые изучаются данным методом – 1 микрон и менее. Принцип действия заключается в использовании потока отрицательно заряженных частиц, которые играют роль светового луча. Линзы в таком микроскопе – магнитные. Отдельные участки исследуемых объектов по-разному задерживают отрицательно заряженные частицы, поэтому изображение получается чёрно-белым, где сам объект увеличен в тысячи раз. Сегодня электронная микроскопия используется для изучения строения, функции и развития клетки. Также применяется в сферах исследования морфологии и структуры микроорганизмов, их жизнедеятельности и генетики. Немаловажный вклад данный метод внес в развитие такой науки как вирусология. Если бы не электронная микроскопия, законы жизнедеятельности клеток были бы до сих пор не изучены, а значит многие онкологические заболевания были бы неизлечимы.

Для того, чтобы провести электронную микроскопию, объекты, которые являются изучаемым материалом, подвергаются физической и химической фиксации, после чего их обезвоживают и разделяют на ультратонкие срезы, чтобы было легче их контрастировать и исследовать.

Электронная микроскопия позволяет увеличивать изображение объекта на много сотен тысяч раз. Минусом данного метода я является то, что он предназначен для изучения неактивных, обезвоженных, мёртвых объектов. Научный вклад в медицину этой методики микроскопии – очень велик, но применять ее в диагностических и практических целях – пока невозможно. Световая и электронная микроскопия имеет общий признак – увеличение изображения с последующим описанием форм объекта и сравнением этих форм с функциональными, а также химическими свойствами

• Иммуноэлектронная микроскопия.

Применяется для исследования взаимодействия антигена и антител. Принцип действия: материал, который исследуется смешивают с иммунной сывороткой, инкубируют его; жидкость и твердые частицы разделяются на фракции по плотности; затем происходит осаждение антител и разделенных частиц на объект; после этого, к смешанному клеточному осадку добавляют вещество, усиливающее контрастность; и только после всего этого, полученный препарат исследуют под микроскопом.

Применяется для диагностики вирусного гепатита, а также для выявления антигенов, которые будут бороться с различными вирусными заболеваниями.

• Световая.

Обеспечивает цветное изображение, увеличенное в две-три тысячи раз. Также, при световой микроскопии возможно продолжительное наблюдение за подвижным объектом, и что немаловажно – микрокиносъёмка. Используется для оценки хода развития объекта, его состояния движения, а также для исследования его изменений под воздействием окружающих его факторов. Кроме разрешающей способности микроскопа, важную роль играет амплитуда светового луча и типология исследуемого объекта, так как свойства последнего имеют огромное влияние на оптическое излучение: цвет, контрастность, резкость, световая фаза, плоскость, по которой распространяется волна. Именно благодаря этим факторам и строится методология микроскопических исследований, например, в данном виде микроскопии, объект окрашивают, чтобы определить его свойства, потому что краска помогает изучить конкретные свойства убитых клеток. Но это не значит, что световая микроскопия занимается изучением лишь мертвых биологических объектов. Благодаря темнопольной микроскопии (подвид оптической), где свойства и чёткость изображения зависит ли излучения, которое рассеивается исследуемым образцом, освещающий световой пучок не попадает в глазок, и картинку изучаемого образца учёные видят в рассеянном свете. Используется для изучения водных одноклеточных организмов, а также живых объектов, которые могут быть как окрашенными, так и наоборот.`]]

Мельчайшие размеры микроорганизмов обусловливают использование для изучения морфологии бактерий точных оптических приборов - микроскопов. Наиболее часто применяются светлопольная микроскопия, микроскопия в темном поле, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия. Для специальных микробиологических исследований используется электронная микроскопия.

Светлопольная микроскопия

Светлопольная микроскопия осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, основной частью которого является объектив. На оправе объективов обозначается увеличение: 8, 10, 20, 40, 90.

При исследовании микробов применяется иммерсионная система (объектив). Иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового масла, нанесенного на препарат. Кедровое масло имеет такой же коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей (рис. 1.12).

Рис. 1.12. Ход лучей в иммерсионном объективе

Изображение, получаемое в объективе, увеличивает окуляр, состоящий из двух линз. В отечественных микроскопах применяются окуляры с увеличением 7, 10, 15 (рис. 1.13). Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. В микробиологии обычно используются увеличения в 900-1000 раз. Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности.

Рис. 1.13. Схема сложного светового микроскопа для наблюдения в светлом поле, отрегулированного для освещения по Келеру

Под этим надо понимать наименьшее расстояние между двумя точками препарата, при котором они еще четко различимы под микроскопом. Разрешающая способность обычных световых микроскопов с иммерсионной системой равна 0,2 мкм.

Темнопольная микроскопия

Микроскопия в темном поле зрения основана на следующем принципе (рис. 1.14). Лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя: поле зрения остается темным, а объект на его фоне оказывается светящимся. Это достигается с помощью специального конденсора (параболоид) или обычного конденсора, прикрытого в центре кружком черной бумаги.

Рис. 1.14. Схема микроскопа для наблюдения в темном поле.

Препараты для темнопольной микроскопии готовят по типу «висячей» и «раздавленной» капли. При приготовлении препарата «раздавленная» капля исследуемый материал (бактериальную культуру в физиологическом растворе) наносят на предметное стекло, которое покрывают покровным стеклом. Капля материала заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, образуя ровный слой. Для приготовления «висячей» капли необходимо использовать специальные предметные стекла с углублением в центре и покровные стекла.

На середину покровного стекла наносят исследуемый материал. Края углубления на предметном стекле смазывают вазелином, и им накрывают покровное стекло так, чтобы капля находилась против центра углубления. Затем переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных микроорганизмов.

Фазово-контрастная микроскопия

При прохождении пучка света через неокрашенный объект изменяется лишь фаза колебания световой волны, что не воспринимается человеческим глазом. Чтобы изображение стало контрастным, необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные. Это достигается с помощью фазово-контрастного конденсора и фазового объектива (рис. 1.15).

Рис. 1.15. Схема фазово-контрастного микроскопа.

Фазово-контрастный конденсор представляет собой обычный объектив с револьвером и набором кольцевых диафрагм для каждого объектива. Фазовый объектив снабжен фазовой пластинкой, которую получают нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива.

Фазово-контрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой (обычно большей) длиной волны (флюоресцировать). Такие вещества называют флюорохромами (акридиновый желтый, родамин и др.). Объект, обработанный флюорохромом, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобретает яркий цвет в темном поле зрения.

Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильтров к нему (рис. 1.16). Очень важно использование нефлуоресцентного иммерсионного масла.
Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.

Рис. 1.16. Схематическое изображение флуоресцентного микроскопа: 1 - дуговая лампа; 2 - кварцевый коллектор; 3 - кювета, заполненная раствором сернокислой меди; 4 - передняя часть коллектора; 5 - ультрафиолетовый фильтр; 6 - призма; 7 - пластинка из уранового стекла; 8 - окулярный фильтр, поглощающий
ультрафиолетовые лучи.

Электронная микроскопия

Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В электронном микроскопе вместо световых волн используются электронные лучи, обладающие чрезвычайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью (рис. 1.17).

Рис. 1.17. Схема трансмиссионного электронного микроскопа.

В качестве источника электронных лучей применяют электронную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электрическим током. Между вольфрамовой нитью и анодом на пути электронов находится электрическое поле высокого напряжения. Электронный поток вызывает свечение фосфоресцирующего экрана. Проходя через объект, части которого имеют различную толщину, электроны будут соответственно задерживаться, что проявится на экране участками затемнения. Объект приобретает контрастность.

Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследуют объекты после их высушивания («нативные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, ультратонких срезов метода реплик и др.

С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получить увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

Важность науки в жизни всего общества отрицать очень сложно. Учёные и их разработки дали обществу всё то, чем оно теперь пользуется с радостью и наслаждается. Разработки учёных в разных областях позволяют побеждать смертельные болезни, бороться с психическими расстройствами, создавать уникальную «умную» технику и даже роботов. Возможности науки поистине безграничны. Новые лица всегда приносят с собой новые идеи, которые становятся основой для будущих разработок. Однако множество разработок базируется на простых и проверенных методах.

Многие мудрецы прошлого говорили о том, что существует макро-, микромир. На том этапе развития люди не могли осознать всю глубину этих слов. Ведь макро- и микромир действительно существуют и очень тесно взаимодействуют. Крохотные изменения в структуре клетки могут быть вызваны глобальными изменениями в Солнечной системе. На сегодняшний день доказать или опровергнуть такую взаимосвязь очень сложно, но исследования мира бактерий и клеток говорят о том, что клетка - это маленькая Вселенная.

Микроскопия

Микроскопия - это научное при помощи микроскопа. В переводе с греческого это слово означает «маленький, небольшой». Микроскопия может подразделяться на несколько подвидов: оптическую, многофотонную, рентгеновскую, лазерную и электронную. Цель этого способа исследования заключается в увеличенном наблюдении за объектом и регистрацией замеченных изменений.

История микроскопа

В начале своего исторического развития микроскопы представляли собой которые использовали лучи видимого света. Такие приборы были очень слабы для наблюдения и подходили только для простейших операций. Идея возникновения электронного микроскопа возникла в тот момент, когда учёные задумались о замене электромагнитного излучения на электронный пучок. Это событие стало для развития электронного микроскопа, который значительно расширил возможности наблюдения за объектом.

Методы микроскопии

Для того чтобы правильно и тщательно обследовать какой-либо объект, необходимо работать по определённому алгоритму. Подобные алгоритмы вырабатываются один раз и применяются годами. Для того чтобы изучать окружающий мир при помощи специальной техники, необходимо владеть особыми методами. Методы микроскопии - это совокупность различных алгоритмов, следуя которым, можно основательно и системно изучить конкретный объект микромира. Прохождение пучка света через микроскоп сопровождается некоторыми изменениями первоначальных характеристик, которые могут быть вызваны структурным строением предмета. Этот процесс может сопровождаться рядов оптических эффектов, таких как отражение, поглощение, преломление, дисперсия и т.д.

Методы световой микроскопии

Световая микроскопия - это система методов, которые используют различные оптические эффекты для достоверного отображения результатов. Видимые элементы и характер полученного изображения будут во многом зависеть от освещения. Всего насчитывается большое количество методов микроскопии: светлого поля, косого освещения, интерференционного контраста, тёмного поля, поляризационный метод, фазово-контрастная, ультрафиолетовая, люминесцентная, инфракрасная микроскопия, конфокальный микроскоп.

Все эти методы имеют определённые достоинства и недостатки. При работе с образцом выбирать тот или иной метод следует исходя из его адекватности в данной ситуации. Сильные и слабые стороны каждого метода не важны в целом, главное, чтобы метод был применим в заданных условиях.

Микроскопия и медицина

Применение микроскопии в медицине имеет огромный потенциал. На сегодняшний день благодаря микроскопам можно исследовать различные клетки организма человека для того, чтобы точно определять состояние здоровья. Клетки организма дают наиболее точный и достоверный результат, который до недавнего времени было невозможно получить, так как микроскопы не могли дать исчерпывающей информации.

Использование таких приборов очень перспективно, ведь методы лечения и диагностики могут разительно преобразиться и вовсе перейти на новый уровень. Исследование с помощью микроскопов известно и применяется длительное время, однако наука стоит на пороге того, чтобы лечить человека клетками. Это уникальная возможность, которая позволит отойти от привычных методов лечения и забыть о лекарствах. Клетка - самый мощный элемент организма. Говорить о том, какую пользу может принести пересадка больному человеку здоровых клеток, просто бессмысленно, ведь это очевидно.

Исследование мочи

Общий анализ мочи - это комплекс мероприятий, которые направлены на исследование свойств мочи и её физико-химического состава. Важными показателями при этом являются цвет, запах, реакция, прозрачность, плотность, а также содержание в моче различных веществ. Микроскопия осадка мочи позволяет определить наличие солей, клеточных элементов и цилиндров. Следует понимать, что моча - это конечный продукт деятельности почек, который может очень точно отображать состояние обменных процессов и крови в организме.

Анализ осадка мочи

Микроскопия мочи позволяет создать более полную картину при полном обследовании организма. Также мазок часто используют для обычной и дифференциальной диагностики болезней мочевыводящих путей и почек. Во время лечения микроскопию мочи могут назначать для того, чтобы получить оценку эффективности докторского вмешательства. Исследование мочи позволяет выявить конкретные или потенциальные проблемы в водно-электролитном балансе организма, также в процессе обмена веществ. Анализ мочи весьма эффективен при диагностике на болезни желудочно-кишечного тракта, а также при инфекционных и воспалительных процессах в организме. Иногда микроскопию мочи используются для того, чтобы следить за состоянием пациента в период терапевтического или хирургического лечения.

Исследование крови под микроскопом

Кровяные тельца формируются в красном костном мозге, а затем выбрасываются в кровоток. Каждая выполняет свою определённую функцию. Лейкоциты нужны для борьбы с инфекционными клетками, эритроциты способствуют обогащению клеток кислородов и удалению из них углекислого газа, тромбоциты очень важны для гемостаза. В нормальных условиях тело человека вырабатывает нормативное значение всех клеток, которое не выходит за определённые рамки. При возникновении каких-либо осложнений или при болезни клетки крови могут менять свои размеры, форму, цвет и количество. Только благодаря точному микроскопическому исследованию можно определить состояние клеток и сделать соответствующие выводы.

Кровь - это живительная жидкость организма, которая обеспечивает обмен полезными веществами между всеми клетками. Микроскопия мазка крови - это исследование, которое производится под микроскопом. Исследуется препарат, приготовленный из одной капли крови. Эта процедура входит в общий анализ крови или лейкоцитарную формулу и отдельно не совершается.

Микроскопия мазка

Для чего нужен Микроскопия мазка крови даёт специалисту очень важные знания о состоянии здоровья человека. При помощи этого анализа можно определить количественное соотношение эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, а также их формы и размер. Кроме того, позволяет определять количественное выражение незрелых лейкоцитов, что является очень важным моментом в ряде заболеваний. Также мазок крови позволяет качественно диагностировать заболевания, которые могут быть связаны с нарушениями функций крови, её образования, свёртываемостью, а также разрушением Очень важной задачей микроскопического мазка на кровь является регулярное отслеживание состояния клеток крови, их зрелость после лучевой и химиотерапии, при проблемах с гемоглобином, а также при лейкозах.

Назначается мазок на кровь в том случае, если общий анализ крови показал, что увеличено количественное выражение лейкоцитов, незрелых или атипичных клеток. Для мазка можно использовать биоматериал из крови или капилляров.

Биология и микроскопы

Биология значительно расширяет возможности использования микроскопов. Как уже говорилось раньше, цитология во многом опирается на современные и мощные микроскопы. Микроскопия в биологии открывает для учёных невиданные просторы для опытов и исследований. Современные разработки позволяют уже сейчас говорить о том, какое будущее нас ждёт.

Микроскопия в биологии имеет очень широкое применение. Приборы позволяют исследовать организмы, которые недоступны глазу человека, но очень важны для научных экспериментов. В биологии чаще всего используют метод электронной микроскопии, который даёт изображение за счёт направленного потока электронов. При этом даже световой микроскоп позволяет исследовать живые биологические объекты.

Метод микроскопии в биологии применяется очень активно, так как практически все разновидности применимы для биологических исследований. Интерференционная микроскопия позволяет исследовать прозрачные жидкости и объекты, а также давать их качественный анализ. Это возможно благодаря тому, что луч света, проходя через прибор, раздваивается: одна его часть проходит через объект, а другая - мимо. Таким образом, два луча интерферируют и соединяются, давая полноценное изображение.

Микроскопия в разных областях применения

Область применения микроскопии очень широка. Несмотря на то что изначально микроскопы были предназначены для исследований в области биологии, на сегодняшний день сфера их влияния значительно расширилась. Микроскопия - это комплекс методов, который нашёл своё применение при анализе твёрдых и кристаллических тел, структуре и строений поверхностей. Также микроскопы активно используются в медицине не только для диагностики, но и при выполнении микрохирургических операций. Более того, известно, что учёными был разработан подводный лазерный микроскоп, цель которого состоит в поиске внеземной жизни на Европе.

Также не следует забывать о бурном развитии нанотехнологий, которые немыслимы без микроскопов. Развитие этой отрасли приводит к тому, что разновидности микроприборов постоянно совершенствуются. Более того, появляются новые которые предназначены для исследования определённой среды.

Подводя некоторые итоги, следует сказать о том, что микроскопия - это перспективная область, которая с каждым годом развивается всё более активно. Интерес к стволовым клеткам человека, а также развитие нанотехнологий ведёт к тому, что микроскопы становятся неотъемлемой частью любой исследовательской работы.